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隨著發(fā)光(luminescence)技術(shù)在多種生物實驗中的廣泛應(yīng)用，生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)越來越成為的生物檢測手段。在這篇文章中，我們將詳細(xì)討論生物發(fā)光技術(shù)在生物檢測中的應(yīng)用，以及它與其它發(fā)光檢測手段相比所顯示出的優(yōu)點。
1 生物發(fā)光的特點
根據(jù)產(chǎn)生光子的能量來源不同，發(fā)光可分為以下四大類，一是熒光(fluorescence)：依靠光子發(fā)光；二是化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)：依靠化學(xué)能量發(fā)光；三是輻射發(fā)光：依靠放射性能量發(fā)光；四是電能發(fā)光：依靠電能量發(fā)光。其中，生物發(fā)光(bioluminescence)是依靠天然的酶促化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量而發(fā)光，屬于化學(xué)發(fā)光，它天然地存在于許多生物體內(nèi)，例如螢火蟲、深海里的水母和一些細(xì)菌。目前，在生命科學(xué)研究中，應(yīng)用的是熒光和化學(xué)發(fā)光。而生物發(fā)光作為化學(xué)發(fā)光的重要類別，也日益受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。物質(zhì)發(fā)光的機理是：分子首先受到激發(fā)，吸收能量，從穩(wěn)定的基態(tài)躍遷到不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，而當(dāng)它從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時，能量就以光子的形式釋放出來(圖1)，檢測發(fā)出的光子就能確定發(fā)光分子的存在。發(fā)光技術(shù)能否在生物檢測中得到應(yīng)用及其應(yīng)用的范圍，在很大程度上取決于激發(fā)分子的能量來源。因為激發(fā)能量的來源不同，其產(chǎn)生的相對信號強度(信號對本底的相對值)則不同，對檢測器的靈敏度要求也不同。以生物發(fā)光和熒光為例：對于熒光來講，一方面，由于熒光的光子能量吸收效率高，分子可以釋放大量的光能，從而產(chǎn)生高強度的光信號，利于檢測；另一方面，這種高流量的激發(fā)光子有時會嚴(yán)重干擾光感檢測器發(fā)射光子的分析能力，同時也可能激發(fā)生物樣品本身含有的熒光團，而產(chǎn)生其它非特異的發(fā)射光，進而導(dǎo)致實驗本底過高。也正是由于熒光的這種特性，即報告基團中高強度的信號與高強度的實驗本底共存，使得其檢測相對信號強度的能力大大降低。對于生物發(fā)光來講，它與熒光形成鮮明對照，因為生物發(fā)光依靠天然的酶促化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，不需要引進外源的光能，所以應(yīng)用生物發(fā)光作為檢測手段的報告基團的實驗本底很底。雖然生物發(fā)光的信號強度沒有熒光那么高，但由于其*的發(fā)光原理，生物發(fā)光可以比熒光敏感一百甚至一千倍以上。這是生物發(fā)光越來越成為很多生物研究領(lǐng)域的生物檢測手段的原因之一。
在實際應(yīng)用時，需要反復(fù)權(quán)衡信號強度的要求和實驗本底的影響，以選擇*的檢測技術(shù)。在光子檢測能力比較低的情況下，實驗本底很大程度上取決于儀器檢測的對象，例如顯微鏡和流式細(xì)胞儀，由于需要檢測單個細(xì)胞光學(xué)信號的變化，對發(fā)射光信號的強度要求非常高，因此，熒光通常會成為這一類應(yīng)用領(lǐng)域的。然而，當(dāng)需要檢測大量的生物樣品的時候，對光子檢測能力的要求就會相應(yīng)降低，對降低實驗本底的要求相應(yīng)會增加，比如在檢測單個試管樣品、多孔培養(yǎng)板樣品，或者對器官(如老鼠器官)進行圖像分析的時候，生物發(fā)光因其低本底和高靈敏度而倍受歡迎。而且由于生物發(fā)光檢測器不需要使用光學(xué)濾片，從而為縮短樣品和檢測器之間的距離提供了可能，由此也更加提高了檢測的效率。生物發(fā)光的靈敏度可以達到10-20 mol，相當(dāng)于6，000多個螢光素酶分子。對于一個有幾百個細(xì)胞的生物樣品來說，一個細(xì)胞里只要有幾個分子的螢光素酶就可以被檢測到。而且生物發(fā)光的高靈敏度使得它可以檢測的濃度范圍非常寬，大多數(shù)可以跨越6～8個數(shù)量級，而且現(xiàn)代生物發(fā)光檢測儀技術(shù)的更新也使得如此大跨度的檢測成為可能。另外，由于生物發(fā)光來源于天然生物體內(nèi)的酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，當(dāng)將其引進生物樣品內(nèi)的時候，對正常的生物活動不會添加太多負(fù)面影響。而且，因為螢光素酶的底物在反應(yīng)時是被包裹在螢光素酶分子的內(nèi)部，從而可以在zui大限度上保護正常的酶促發(fā)光反應(yīng)不受外界的干擾。
2 生物發(fā)光作為報告基因的應(yīng)用及其優(yōu)點
生物發(fā)光在生命科學(xué)研究中zui廣泛的應(yīng)用是作為監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄活動的報告基因。其中，螢火蟲體內(nèi)天然存在的螢光素酶通常是研究人員的。螢火蟲的螢光素酶是一個61kDa的單體蛋白，它主要催化作用于名為螢光素(luciferin)的螢光素酶底物，在有ATP和氧氣存在的條件下產(chǎn)生黃綠色的光(發(fā)射光波長是560 nm)。
當(dāng)使用報告基因來監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄活性的時候，研究人員zui大的顧慮是引進外源的報告基因可能會影響正常的生物活性，尤其是當(dāng)報告基因通常需要和生物體內(nèi)自身細(xì)胞的分子活動相時，高濃度的外源基因會過分加重生物內(nèi)部細(xì)胞活動的負(fù)擔(dān)，從而影響正常的生理活動，甚至造成不正常的生理現(xiàn)象。因此，盡量降低報告基因的濃度就成為研究成功的關(guān)鍵。以綠色熒光蛋白為例，它是一類天然存在的發(fā)光蛋白，由于它能產(chǎn)生高強度的發(fā)射熒光，所以可以獲得非常清晰、生動的顯微圖像，在單細(xì)胞生物圖像分析中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但因為清晰圖像的產(chǎn)生通常需要綠色熒光蛋白高濃度表達，從而加重了生物內(nèi)部細(xì)胞活動的負(fù)擔(dān)，使得綠色熒光蛋白不適合作為監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄活動的報告基因。所以在選擇合適的報告基因時，特別是和綠色熒光蛋白相比較之后，生物發(fā)光由于其低表達和高靈敏度使其在眾多的選擇中脫穎而出。
監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄活性要求報告基因能夠快速監(jiān)測目標(biāo)基因細(xì)微的動態(tài)變化。細(xì)胞內(nèi)報告基因的濃度取決于兩大動態(tài)過程：即蛋白合成過程(受基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控)和蛋白降解過程。如果蛋白降解過程很慢，則會使蛋白高度穩(wěn)定，從而會造成蛋白的本底表達水平過高，那么基因轉(zhuǎn)錄活性改變所產(chǎn)生的新蛋白的合成就不容易被檢測到。這樣一來，報告基因的表達就不能準(zhǔn)確地反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。實驗證明，在螢光素酶的序列上添加蛋白降解序列，如小鼠鳥氨酸脫羧酶(mouse ornithine decarboxylase， ODC)中富含脯氨酸- 谷氨酸- 絲氨酸- 蘇氨酸(proline-glutamate-serinethreoninerich，PEST)的序列，可以顯著地提高檢測技術(shù)的應(yīng)答性，并且不會對檢測手段的靈敏度造成太大影響。與之相反，由于綠色熒光蛋白的高表達和高穩(wěn)定性，使得添加蛋白降解信號反而在很大程度上限制了檢測的靈敏度。
為了進一步提高檢測基因的效率，我們對螢光素酶基因序列的密碼子進行了優(yōu)化，使得它在多種哺乳細(xì)胞中的表達水平提高了5～10倍；同時，為了減少對基因的非特異性調(diào)控，我們也對螢光素酶的載體進行了優(yōu)化，去除了載體上哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的保守序列，從而大大降低了實驗的本底，顯著提高了實驗的相對信號強度。優(yōu)化后的螢光素酶報告基因可以成功地應(yīng)用在各項生物研究領(lǐng)域中，例如對腫瘤壞死因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。腫瘤壞死因子是由單核- 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的能致腫瘤細(xì)胞壞死的活性因子，能加強中性粒細(xì)胞的吞噬和消化功能，促進其粘附于血管內(nèi)皮和遷移出血管之外，并能激活轉(zhuǎn)錄因子NF- B調(diào)控的包括IL-1、GM-CSF在內(nèi)的多種基因的表達。在外源表達NF- B螢光素酶報告基因的HEK293 細(xì)胞中，腫瘤壞死因子的刺激可以有效地使螢光素酶的表達提高1000 倍以上。同樣的檢測方法也可以成功地檢測腫瘤壞死因子阻斷劑對腫瘤壞死因子生物活性的阻斷效率(IC50=0.77 nmol)。
3 生物發(fā)光的其它應(yīng)用
生物發(fā)光的強度取決于酶促化學(xué)反應(yīng)中的各個反應(yīng)成分的濃度，包括熒光素酶濃度、ATP濃度和螢光素酶底物即螢光素的濃度。通常，在生物發(fā)光的檢測體系中，如果保持其它成分的濃度過量且恒定，就可以檢測與生物活性相關(guān)的某個特定成分的濃度變化。我們上面談到的用螢光素酶作為報告基因來監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄活性的實驗，就是把螢光素酶濃度和基因轉(zhuǎn)錄活性直接關(guān)聯(lián)起來，螢光素酶濃度是我們的zui終監(jiān)測目標(biāo)。此外，如果我們固定螢光素酶的濃度并使其過量，生物發(fā)光還可以用來監(jiān)測與ATP或螢光素濃度相關(guān)的生物學(xué)活性。
通過檢測螢光素的濃度來監(jiān)測某一生物學(xué)活性的實驗原理是：在螢光素上添加一個化學(xué)基團進行修飾，建立一個螢光素酶無法識別的"修飾"底物，而只有通過特定的生物反應(yīng)切除這個化學(xué)基團，螢光素才能恢復(fù)活性，酶促反應(yīng)才能發(fā)生，這樣我們就可以把生物發(fā)光的強度和這個特定的生物反應(yīng)起來。Asp-Glu-Val-Asp-6'-aminoluciferin是一個沒有活性的螢光素衍生物，只有當(dāng)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)存在并切除這個四肽的序列，釋放出游離的螢光素時，螢光素酶酶促反應(yīng)才能發(fā)生。因為半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的活性是檢測細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)，這樣的設(shè)計使生物發(fā)光成為一個有效的檢測細(xì)胞凋亡的手段。當(dāng)然這一設(shè)計也可以用于運用熒光的細(xì)胞凋亡檢測上，即把同樣四肽的序列加到熒光染料Rhodamine110上。但由于生物發(fā)光*的低表達和高靈敏度，在相同的實驗條件下，運用生物發(fā)光研究細(xì)胞凋亡，其敏感性比運用熒光技術(shù)高將近一百倍。類似的設(shè)計也可以用來利用生物發(fā)光檢測其它蛋白酶的活性，比如caspase-8、caspase-9、二肽基肽酶Ⅵ(DPPIV)、caspase-3、鈣蛋白酶(calpain)、蛋白酶體(proteosome)等，并且還可以檢測其它如CYP450活性、單氨氧化酶等的酶促反應(yīng)。
生物發(fā)光zui早用于檢測ATP的濃度，并且迄今為止仍然是快速檢測細(xì)胞活力zui廣泛使用的方法之一。與基于熒光的細(xì)胞活力檢測方法(如使用tetrazolium)相比，用生物發(fā)光來檢測哺乳細(xì)胞的生物活性，其敏感度要高達一百倍以上，而且只需要5 min。用生物發(fā)光來檢測細(xì)菌的生物活性，靈敏度非常高，細(xì)菌個數(shù)小于10時，都可以被檢測到。用生物發(fā)光檢測ATP的方法還可用于檢測消耗ATP的生物酶的濃度。以激酶為例，由于它可以作用于不同的磷酸鹽受體，包括蛋白、脂類和多糖底物，這種方法可以作為一個通用的檢測激酶活性的手段。zui近，我們利用cAMP對蛋白激酶A的調(diào)控和蛋白激酶A的激酶反應(yīng)對ATP的消耗建立了一個檢測cAMP濃度變化的生物發(fā)光檢測方法。具體來說，細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度可調(diào)節(jié)蛋白激酶A 的活性，而蛋白激酶A被激活后催化相應(yīng)的磷酸化反應(yīng)則需要消耗ATP，這樣一來細(xì)胞內(nèi)ATP濃度就會降低，因此，我們檢測到的ATP的濃度就與蛋白激酶A的活性成反比，也與cAMP的濃度成反比。由于我們能夠?qū)⑸锇l(fā)光和ATP濃度直接關(guān)聯(lián)起來，所以我們建立了一個細(xì)胞內(nèi)檢測G蛋白-偶聯(lián)受體活性或磷酸去脂酶活性的快速敏感的檢測方法。
4 結(jié)語
生物發(fā)光在復(fù)雜的生物有機體研究中具有巨大的潛力和價值。無論是它在很低的濃度下就可以發(fā)出清晰并定量的信號這一特性，還是它在哺乳細(xì)胞中低本底的優(yōu)點，都使得生物發(fā)光技術(shù)在揭示生命奧秘的過程中擁有*的地位。因此，生物發(fā)光檢測技術(shù)必將在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究和新藥開發(fā)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮越來越強大的作用。
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